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豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）是尼多病毒目（Nidovirales,又叫巢穴病毒目或套式病毒目）、冠狀病毒科（Coronaviridae）的α冠狀病毒屬成員，能夠引起新生仔豬急性腹瀉、嘔吐、脫水甚至死亡。
PEDV表面具有1個(gè)18~23nm纖突的囊膜結(jié)構(gòu)，纖突呈花瓣?duì)睿珊诵南蛩闹艹史派錉罘植?，纖突末端呈球狀；病毒直徑為95~190nm，是一種單股正鏈、不分節(jié)段RNA病毒。PEDV基因組大小約為28kb，含有７個(gè)開放閱讀框，分別編碼大小為150~220kDa的病毒纖突糖蛋白（S）、20~30kDa的基質(zhì)蛋白（M）、7kDa的主要嵌膜蛋白（E）、58kDa的核衣殼蛋白（N）與其他蛋白。病毒表面的纖突蛋白（spike，S）具有介導(dǎo)細(xì)胞附著和膜融合的作用。
目前預(yù)防豬流行性腹瀉（PED）的疫苗常用甲醛氫氧化鋁滅活苗，但疫苗株與近期流行株同源性較低，能保護(hù)仔豬免受PEDV流行株感染的高效廉價(jià)的疫苗需求更加迫切。為此，來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院的研究團(tuán)隊(duì)針對(duì)高發(fā)的GⅡ-a型流行株豬PEDV的纖突蛋白中的受體結(jié)合區(qū)（re-ceptor-bindingdomain,RDB），應(yīng)用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建并表達(dá)了PEDV-RDB基因，通過仔豬試驗(yàn)，分析其免疫原性，為PED亞單位疫苗研制提供新思路。
PEDV-RDB基因在昆蟲桿狀病毒中的表達(dá)與鑒定
根據(jù)PEDV S蛋白基因序列(AKN45969.1)將目的基因設(shè)計(jì)合成之后，將合成的基因PEDV-RBD亞克隆至桿狀病毒雙表達(dá)載體的PH啟動(dòng)子下游，進(jìn)行重組和鑒定。對(duì)重組桿粒Bacmid-PER進(jìn)行鑒定，利用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定成功后隨后對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)染，獲得重組桿狀病毒rBV-PER。
PEDV-RBD基因結(jié)構(gòu)示意圖
左：重組質(zhì)粒鑒定 右：PCR鑒定
最后利用Anti-strep tag抗體和抗PEDV S蛋白抗體對(duì)重組桿狀病毒進(jìn)行IFA鑒定，表明外源PEDV-RBD基因在桿狀病毒中成功表達(dá)。
IFA鑒定PEDV-RBD蛋白的表達(dá)
重組蛋白pFBD-PER的Western blot鑒定
普健生物昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)物利用經(jīng)典Bac-to-Bac 技術(shù)，打造了一個(gè)快速簡(jiǎn)便高效的桿狀病毒表達(dá)平臺(tái)；能夠快速地產(chǎn)生重組病毒，而且不需要繁瑣的空斑分析，大大提高了效率，蛋白生產(chǎn)的周期短，通量大?？梢詫?shí)現(xiàn)細(xì)胞從小規(guī)模培養(yǎng)到大規(guī)模發(fā)酵的過程，使得蛋白產(chǎn)物甚至可以達(dá)到100mg/L 的級(jí)別。如果您有相關(guān)重組蛋白表達(dá)和制備需求，歡迎聯(lián)系027-87001869與我們的專員進(jìn)行溝通！
利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備豬流行性腹瀉病毒（PEDV）纖突蛋白受體結(jié)合區(qū)（RDB）重組蛋 白（PEDV-RDB），將其免疫３周齡斷乳仔豬，分析其免疫原性。將PEDV-RBDP3代重組桿狀病毒接種到懸浮SF9細(xì)胞中，收獲后離心取上清液，將上清液超速離心濃縮重組蛋白。將仔 豬分為免疫組、空載體對(duì)照組和佐劑對(duì)照組，分別用制備的重組蛋白、空載體表達(dá)產(chǎn)物和單純佐劑免疫仔豬。
特異性抗體檢測(cè)結(jié)果
左：仔豬血清中和抗體檢測(cè)結(jié)果 右：流式細(xì)胞術(shù)分析
結(jié)果顯示，免疫后８周，PEDV-RDB重組蛋白組產(chǎn)生的特異性抗體效價(jià)達(dá)1:12800，中和抗體平均效價(jià)1:284，最高達(dá)1:512。流式細(xì)胞術(shù)分析CD3+CD4+雙陽性Ｔ淋巴細(xì)胞顯著高于對(duì)照組，表明重組蛋白具有良好的免疫原性，能夠激發(fā)仔豬的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。
這項(xiàng)研究這為進(jìn)一步利用桿狀病毒載體制備亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)，也為利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行其他冠狀病毒蛋白的免疫研究提供了借鑒和參考。
參考文獻(xiàn)
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