概述(Summary)icon

產(chǎn)品中文名

無縫克隆試劑盒

產(chǎn)品貨號

ATO00037

產(chǎn)品描述(Description)

1.產(chǎn)品介紹

無縫克隆是一種新型、快速并且高效的Gibson Assembly DNA定向克隆技術(shù)，可以同時將多個DNA片段克隆到任何載體中,并且最終構(gòu)建的克隆沒有任何額外的堿基序列，因此被稱作“無縫克隆”。

和傳統(tǒng)的基因克隆方法相比，本試劑盒的無縫克隆技術(shù)有多方面的優(yōu)勢：(1)操作更簡單，只需要一次反應(yīng)即可完成;(2)對酶切位點無要求，可以把目的片段插入到任意載體的任意位點;(3)連接片段之間不會引入任何多余的序列，是真正的無縫克隆;(4)陽性克隆率高，降低克隆篩選的工作量。

本試劑盒操作簡單，僅需將載體在插入位點進行線性化，同時將目的片段兩端引物與載體插入位點同源的15-25bp序列，將線性化的克隆載體和帶有同源序列的PCR片段按合適比例混合，并加入2×Master Mix，在重組酶的催化下，50℃反應(yīng)30min即可快速完成定向克隆，陽性率高達90%以上。試劑盒中2×Master Mix預(yù)混了DNA外切酶、DNA聚合酶、連接酶和重組反應(yīng)所需緩沖液，并添加了特殊的酶激活組分，可顯著提高重組克隆效率，可以一次實現(xiàn)多至3-6個片段的順序拼接克隆。

2.試劑盒原理示意圖

 

 

圖1. 無縫克隆試劑盒原理示意圖 。 單酶切/雙酶切獲得線性化載體。擴增與載體帶有同源臂的目的片段(藍色和紅色部分為同源部分)。按一定的比例將二者混合在2×Master Mix預(yù)混液中，50℃反應(yīng)30min后直接轉(zhuǎn)化E.coli即可。

產(chǎn)品優(yōu)勢(Advantage)

和傳統(tǒng)的基因克隆方法相比，本試劑盒的無縫克隆技術(shù)有多方面的優(yōu)勢：

(1)操作更簡單，只需要一次反應(yīng)即可完成;

(2)對酶切位點無要求，可以把目的片段插入到任意載體的任意位點;

(3)連接片段之間不會引入任何多余的序列，是真正的無縫克隆;

(4)陽性克隆率高，降低克隆篩選的工作量。

儲存條件(Storage)

于-20℃避光保存12個月，避免反復(fù)凍融。

運輸方式(Shipping)

干冰運輸。

Note

For research use only .

 

使用方法(Standard Operating Procedure)icon

1.線性化載體的制備線性化載體制備的兩種方法：

(1)在目標(biāo)載體質(zhì)粒上選取合適的位點，進行單酶切或者雙酶切，酶切后割膠純化;

(2)反向PCR擴增載體，在線性化位點設(shè)計一對互補的引物，進行擴增。

注意：載體質(zhì)粒單酶切容易造成載體切割不完全和載體自連，導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，所以盡可能的選擇雙酶切。請務(wù)必割膠回收線性化的載體，否則殘余的環(huán)狀質(zhì)粒會產(chǎn)生背景菌落。一般回收后的線性化載體濃度需要>15ng/µl。

2. 目的基因片段的制備設(shè)計引物進行目的片段的擴增：

(1)PCR引物必須包含兩個部分，引物的5"端必須包含與載體末端完全同源的15-25bp堿基，引物的3’端必須包含靶基因特意引物序列。

(2)每條引物的3’端必須具有目的基因特異性，長度為15-25bp，GC%為40%-60%，退火溫度Tm為58℃-65℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)跑膠，割膠純化待用。

(3)當(dāng)有多個片段插入時，首片段和末尾片段引物的5"端必須包含與載體末端完全同源的15-25bp堿基。其余中間片段引物的5"端必須包含與前一個片段15bp左右同源序列，3"端必須包含與后一個片段15bp左右同源序列。

　　

 

 

圖3.目的片段引物設(shè)計示意圖

3.反應(yīng)體系的設(shè)置

參考下表在冰上配制重組反應(yīng)體系：

2 ×Master Mix	5ul
Linearized vector	50-200ng
Purified PCR Fragment	20-200ng
Total	10ul

反應(yīng)條件：插入單個片段，一般需50℃反應(yīng)30min;隨著插入片段的增多，長度的加大，反應(yīng)時間隨之延長，一般需要45-60min。

注意：線性化載體與目的片段的加入量可以根據(jù)各自的濃度，片段的長度自行調(diào)整。目的片段與線性化載體的摩爾比在3:1左右，過高或過低都會降低重組效率。

4.轉(zhuǎn)化及陽性克隆的鑒定

(1)取100μl待轉(zhuǎn)化感受態(tài)，置于冰上解凍。

(2)向上述感受態(tài)細胞懸浮液中加入10μl重組好的反應(yīng)液(按第3步操作)，輕輕混勻，不能震蕩，將該混合物置于冰上30 min。

(3)在42℃的水浴中熱激90 sec，立即置于冰上保存2 min，再加入500 μl LB培養(yǎng)基(不含抗性)，37 ℃搖床200rpm震蕩培養(yǎng)1h左右。

(4)取上述轉(zhuǎn)化混合液200-300μl，涂布在選擇性固體培養(yǎng)基上(含相應(yīng)抗生素)，待菌液被培養(yǎng)基充分吸收后，將平板倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

(5)挑平板上的克隆進行菌落PCR，或提質(zhì)粒雙酶切鑒定陽性克隆。