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一、實驗設計
根據(jù)客戶的預期蛋白量、純度以及蛋白用途等需求，通過哺乳系統(tǒng)來分泌表達純化目的蛋白。設計思路為：密碼子優(yōu)化最適宜哺乳系統(tǒng)的基因序列，將目的蛋白序列構建到普健生物自主研發(fā)的高效表達載體pATX2，N端添加哺乳系統(tǒng)常用信號肽利于分泌表達，C端添加His標簽，便于蛋白的檢測和親和純化，瞬時轉染哺乳細胞HEK293，通過SDS-PAGE檢測蛋白表達情況，收集培養(yǎng)基部分用鎳柱親和純化獲得目的蛋白。
二、蛋白性質分析
2.1信號肽分析
2.2疏水性分析
2.3跨膜結構域分析
綜上所述：
1.目的蛋白理論分子量為 43KDa，適宜表達。
2.對蛋白的信號肽，跨膜結構域和親疏水性分析，蛋白整體疏水性略強。
3.目的蛋白自身無信號肽，添加哺乳系統(tǒng)常用信號肽，利于蛋白分泌表達。
4.在C端添加His標簽，便于蛋白的檢測和親和純化。
三、實驗方法
3.1 轉染前一天，接種細胞到完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞在轉染當天處于對數(shù)生長期。
3.2 轉染復合物的準備。
3.3 轉染：加入轉染混合物到細胞懸液中，輕柔混勻后培養(yǎng)至細胞活率降到50%以下收樣。
3.4 收集表達后的細胞液，將培養(yǎng)基上清標記為culture medium;細胞加入1×PBS混勻，超聲后離心，上清吸至新的EP管中，標記為NPE，沉淀加入1×PBS(含8M尿素)，混勻，標記為DPE。
3.5 鎳柱親和純化：
3.5.1 用PBS，pH 7.5緩沖液平衡鎳柱，以0.5 ml/min流速上樣;
3.5.2 用Wash-Buffer以1 ml/min流速沖洗;
3.5.3 用Elution-Buffer以1 ml/min流速洗脫目的蛋白，收集流出液;
3.5.4 將上述收集的蛋白溶液放入透析袋中，使用PBS(pH 7.5)進行透析過夜;
3.5.5 進行SDS-PAGE分析。
四、實驗結果
4.1 蛋白鎳柱親和純化樣品SDS-PAGE分析：
4.2純化后樣品濃縮透析之后進行SDS-PAGE分析：
結論：目的蛋白已成功表達純化，并且純化得到的蛋白純度較高，在90%以上。
五、樣品信息
| 蛋白 | 濃度 | 規(guī)格 | 數(shù)量 | 總量 |
| 重組蛋白A | 2.5 mg/ml | 1.00 ml/vial | 2 vials | 5.00 mg |
六、結論
目的蛋白表達量為62.5 mg/L, 純度大于90%。
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