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免疫沉淀(姊妹篇):常見問題&解決方案

發(fā)表時(shí)間:2023-01-31 訪問次數(shù):477
免疫沉淀技術(shù)可以與基因組技術(shù)、放射同位素技術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、免疫印跡等實(shí)驗(yàn)方法相結(jié)合,對(duì)較復(fù)雜的蛋白質(zhì)與DNA/RNA的關(guān)系和定位提供非常好的解決方法。先了解這幾種方法的區(qū)別:
種類 研究對(duì)象 結(jié)合技術(shù)

染色質(zhì)免疫沉淀

(CHIP)

DNA-蛋白質(zhì) PCR

蛋白質(zhì)免疫沉淀

(PIP)

抗原-抗體 蛋白免疫印跡

放射免疫沉淀

(RIP)

抗原-抗體 放射性同位素技術(shù)

當(dāng)然,再結(jié)合其他技術(shù)還可以衍生出更多的技術(shù),本篇先來剖析一下染色質(zhì)免疫沉淀(CHIP)。

CHIP

染色質(zhì)免疫沉淀 (ChIP) 是研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。其原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物,并將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段,然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體,特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段。后期通過對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè),從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。

應(yīng)用:ChIP可以用來檢測(cè)體內(nèi)反式作用因子與DNA的動(dòng)態(tài)作用,還可以用來研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系。而且,ChIP與其他方法的結(jié)合擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍:ChIP與基因芯片相結(jié)合建立的ChIP-on-chip方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選;ChIP與體內(nèi)足跡法相結(jié)合,用于尋找反式因子的體內(nèi)結(jié)合位點(diǎn);RNA-ChIP用于研究RNA在基因表達(dá)調(diào)控中的作用。

操作也可以很簡(jiǎn)單
1

甲醛處理細(xì)胞

2

收集細(xì)胞,超聲破碎

3

加入目的蛋白的抗體,與靶蛋白-DNA復(fù)合物相互結(jié)合

4

加入ProteinA,結(jié)合抗體-靶蛋白-DNA復(fù)合物,沉淀

5

對(duì)沉淀下來的復(fù)合物進(jìn)行清洗,除去一些非特異性結(jié)合

6

洗脫,得到富集的靶蛋白-DNA復(fù)合物

7

解交聯(lián),純化富集的DNA-片斷

8

PCR或基因芯片分析

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翹首以待實(shí)驗(yàn)成果

然后有人歡喜有人憂

怎么把“驚嚇”變成“驚喜”

this is a question

只要找到破解方法,

所有的問題都不是問題!

今天我們就來一一擊破

免疫沉淀系列實(shí)驗(yàn)中那些揪心的問題。

 
1 WB結(jié)果背景高且不均勻
原因 方案
洗滌不充分 離心前蓋上管蓋反復(fù)顛倒幾次
抗體濃度太高 檢查推薦抗體用量,嘗試使用更少的抗體
抗體特異性不夠 使用親和純化的抗體,最好預(yù)先吸收
封閉不充分 優(yōu)化封閉時(shí)間/溫度,室溫封閉1小時(shí)或4℃封閉過夜
封閉液中與其他蛋白發(fā)生抗體的交叉反應(yīng) 換一種不同的封閉液;不要用含抗生素蛋白的牛奶封閉,牛奶含生物素
操作設(shè)備被污染 保證電泳儀器、印跡儀器和孵育用容器清潔,無外源污染物
 
2 WB結(jié)果信號(hào)弱或無信號(hào)
原因 方案
蛋白未轉(zhuǎn)到膜上 可以用麗春紅染膜并結(jié)合染膠(考馬斯亮藍(lán))后確定條帶是否轉(zhuǎn)至膜上或轉(zhuǎn)移過頭;適當(dāng)調(diào)整轉(zhuǎn)膜的時(shí)間和電流
一抗、二抗等不匹配 選擇針對(duì)一抗來源的種屬抗體
過度封閉 使用含0.5%脫脂奶粉或無脫脂奶的抗體稀釋液;試用不同的封閉液;減少封閉時(shí)間
洗膜過度 洗膜時(shí)間不宜過長(zhǎng),加入的去垢劑不宜過強(qiáng)或過多,建議使用0.05%的弱去垢劑Tween-20
曝光時(shí)間太短 延長(zhǎng)膠片的曝光時(shí)間,超感應(yīng)化學(xué)發(fā)光底物會(huì)持續(xù)發(fā)光至少6個(gè)小時(shí)
 
3 雜帶較多/特異性條帶異常
原因 方案
細(xì)胞傳代次數(shù)過多,蛋白表達(dá)模式分化 使用原始或傳代少的細(xì)胞株或進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)
樣本處理過程中目的蛋白發(fā)生降解

使用新鮮制備的標(biāo)本并使用蛋白酶抑制劑;樣本處理時(shí)在冰上操作

一抗不純 使用單克隆或親和純化的抗體,減少非特異條帶
一抗特異性不高 重新選擇或制備高特異性的抗體

如果你的WB實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)了這些問題,

這些方案供你參考,

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問題多,方法更多。

小編更希望你們實(shí)驗(yàn)開掛,這些問題統(tǒng)統(tǒng)木有!

 

 
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