骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（Bone morphogenetic protein 4,BMP4）是骨形成蛋白家族的一員，隸屬于 TGF-β超家族，在調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、干細(xì)胞分化和成人組織穩(wěn)態(tài)等方面起重要的調(diào)控作用。

在過往的研究中，Klösch等將鼠源BMP4在重組大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，但表達(dá)系統(tǒng)不能對外源蛋白進(jìn)行修飾，會形成不溶解、無活性的包涵體，并存在后期蛋白復(fù)性實驗煩瑣、復(fù)性率較低等問題；Cha等將人源BMP4在中國倉鼠卵巢細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)，結(jié)果證明哺乳動物活細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)在大量生產(chǎn)蛋白時成本較高，不適合大規(guī)模生產(chǎn)的需求。在BMP4蛋白純化方面，普遍選擇使用親和層析技術(shù)，如免疫親和層析、染料－配體親和層析、固定化金屬離子親和層析等，但親和層析技術(shù)雖然操作方便，卻同樣存在成本較高、不宜大規(guī)模生產(chǎn)等問題。因此，優(yōu)化BMP4表達(dá)方法、提高利用效率、降低純化成本，對后續(xù)研發(fā)和生產(chǎn)至關(guān)重要。

畢赤酵母（Pichia pastoris）表達(dá)系統(tǒng)是近年來發(fā)展迅速、應(yīng)用廣泛的一種真核表達(dá)系統(tǒng)。它是甲醇營養(yǎng)型酵母菌，有兩個乙醇氧化酶（Alcohol oxidase，AOX）編碼基因AOX1和AOX2，兩者序列相似，AOX1基因嚴(yán)格受甲醇誘導(dǎo)和調(diào)控。當(dāng)甲醇為唯一碳源時，AOX1啟動子可被甲醇誘導(dǎo)，啟動乙醇氧化酶的表達(dá)，從而用甲醇進(jìn)行代謝，含AOX1 啟動子的質(zhì)?？捎脕泶龠M(jìn)編碼外源蛋白的目的基因的表達(dá)。在此研究中，來自吉林師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院的研究人員以骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP4）為研究對象，將BMP4基因與IgG Fc 基因結(jié)合，改造成為BMP4融合蛋白，經(jīng)畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)和DEAE陰離子純化獲得目的蛋白，并利用間充質(zhì)干細(xì)胞驗證了其生理活性。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前較為常見的表達(dá)系統(tǒng)之一，其優(yōu)點在于表達(dá)高效、穩(wěn)定性好、生產(chǎn)成本低，可根據(jù)需要選擇胞內(nèi)或胞外分泌路徑。其中，胞外分泌表達(dá)純化工藝簡單、生產(chǎn)成本低，適用于工業(yè)生產(chǎn)。用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的甲醇對同一菌種進(jìn)行誘導(dǎo)并對重組蛋白純化進(jìn)行優(yōu)化。

離子交換層析方法可以根據(jù)電荷性質(zhì)差異分離電離分子，具有處理能力強、適用廣泛、成本
適中等優(yōu)點，同時還有易于放大和自動化處理等特性，在大批量生產(chǎn)中發(fā)揮重要的作用。采用離子交換層析法分離、純化目的蛋白，通過BMP4形成二聚體時具有促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的特性，驗證了BMP4-Fc融合蛋白的活性。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)可對目的蛋白進(jìn)行翻譯后修飾，具有高效分泌表達(dá)的真核表達(dá)系統(tǒng)。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)主要優(yōu)勢：
1. 含有特有的強有力的 AOX（醇氧化酶基因）啟動子，用甲醇可嚴(yán)格地調(diào)控外源基因的表達(dá)
2. 產(chǎn)物易分離，畢赤酵母所用發(fā)酵培養(yǎng)基十分廉價，一般碳源為甘油或葡萄糖及甲醇，其余為無機鹽，培養(yǎng)基中
不含蛋白，有利于下游產(chǎn)品分離純化
3. 外源蛋白基因遺傳穩(wěn)定，外源基因能以高拷貝數(shù)整合到畢赤酵母基因組中，不易丟失并能夠得到高表達(dá)菌株
4. 作為真核表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母具有真核生物的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，具有糖基化、脂肪?；?、蛋白磷酸化等翻譯后修飾加工功能

該項研究進(jìn)一步純化了重組蛋白、優(yōu)化了DEAE離子交換層析條件，發(fā)現(xiàn)在230mmol/L NaCl和20mmol/L Tris-HCl混合液洗脫條件下，可以除去大部分雜蛋白，得到純度較高、生理活性好、接近商業(yè)化純品水平的目的蛋白，為BMP4的進(jìn)一步研究、開發(fā)和利用提供了參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：
[1].ZHAO Zhuo,JI Hao-tian,XIAO Ye-chen.Vector construction and purification analysis on recombinant BMP4 protein in Pichia pastoris.[J].JournalofNortheastNormalUniversity(NaturalScienceEdition)Vol.54No.1.March 2022